Метод Грама
Метод Грама — метод окраски микроорганизмов для исследования, позволяющий дифференцировать бактерии по биохимическим свойствам их клеточной стенки. Предложен в 1884 году датским врачом Гансом Кристианом Грамом.
По Граму бактерии окрашивают анилиновыми красителями — генциановым или метиловым фиолетовым и др., затем краситель фиксируют раствором иода. При последующем промывании окрашенного препарата спиртом те виды бактерий, которые оказываются прочно окрашенными в синий цвет и имеющие толстую клеточную стенку, называют грамположительными бактериями, обозначаются Грам (+), — в отличие от грамотрицательных (тонкая клеточная стенка), Грам (−), которые при промывке обесцвечиваются.
После промывания растворителем при окрашивании по Граму добавляется контрастный красный краситель, который окрашивает все грамотрицательные бактерии в красный или розовый цвет. Тест классифицирует бактерии, разделяя их на две группы относительно строения их клеточной стенки.
Использование в диагностике
Окраска по Граму имеет большое значение в систематике бактерий, а также для микробиологической диагностики инфекционных заболеваний.
Грамположительны кокковые (кроме представителей рода Neisseria) и спороносные (за исключением Coxiella burnetii) формы бактерий, они окрашиваются в сине-чёрный (тёмно-синий) цвет.
Грамотрицательны многие неспороносные бактерии, они окрашиваются в красный или розовый цвет.
Техника проведения окраски
Окраска по Граму относится к сложному способу окраски, когда на мазок воздействуют двумя красителями, из которых один является основны́м, а другой — дополнительным. Кроме красящих веществ при сложных способах окраски применяют обесцвечивающие вещества: спирт, кислоты и др.
Для окраски по Граму чаще используют анилиновые красители трифенилметановой группы: генциановый, метиловый фиолетовый или кристаллвиолет. Грамположительные микроорганизмы дают прочное соединение с указанными красителями и йодом. При этом они не обесцвечиваются при воздействии на них спиртом, вследствие чего при дополнительной окраске фуксином грамположительные микроорганизмы не изменяют первоначально принятый фиолетовый цвет.
Грамотрицательные микроорганизмы образуют с основными красителями и иодом легко разрушающееся под действием спирта соединение. В результате микробы обесцвечиваются, а затем окрашиваются фуксином, приобретая красный цвет.
Подготовка материала для окраски
- Исследуемый материал распределяют тонким слоем по поверхности хорошо обезжиренного предметного стекла.
- Приготовленный мазок высушивают на воздухе и после полного высыхания фиксируют.
- Гистологические срезы готовят по стандартной методике, фиксируя кусочки тканей в формалине и заливая в парафин.
Фиксация
При фиксировании мазок закрепляется на поверхности предметного стекла, и поэтому при последующей окраске препарата микробные клетки не смываются. Кроме того, убитые микробные клетки окрашиваются лучше, чем живые.
Различают физический способ фиксации, в основу которого положено воздействие высокой температуры на микробную клетку, и химические способы, предусматривающие применение химических средств, вызывающих коагуляцию белков цитоплазмы.
Физический способ фиксации
Предметное стекло с препаратом берут пинцетом или I и II пальцами правой руки за рёбра мазком кверху и плавным движением проводят 2—3 раза над верхней частью пламени горелки. Весь процесс фиксации должен занимать не более 2 с.
Надёжность фиксации проверяют следующим приёмом: свободную от мазка поверхность предметного стекла прикладывают к тыльной поверхности левой кисти. При правильном фиксировании мазка стекло должно быть горячим, но не вызывать ощущения ожога (70—80°C).
Химический способ фиксации
Для фиксации мазков применяют метиловый спирт, ацетон, смесь Никифорова (смесь этилового спирта 96 % и наркозного эфира в соотношении 1:1), жидкость Карнуа (96-процентного этилового спирта — 60 %, хлороформа — 30 %, ледяной уксусной кислоты — 10 %), спирт-формол (40-процентного формалина — 5 мл, 96-процентного этилового спирта — 95 мл). Предметное стекло с высушенным мазком погружают в склянку с фиксирующим веществом на 10—15 минут и затем высушивают на воздухе. Применяется также фиксация в парах 40-процентного формалина в течение нескольких секунд.
Процесс окрашивания мазков
- На фиксированный мазок наливают один из осно́вных красителей на 2—3 минуты. Во избежание осадков окрашивают через фильтровальную бумагу.
- Сливают краску, аккуратно удаляют фильтровальную бумагу. Мазок заливают раствором Люголя или йодистым раствором по Граму (водный раствор йодида калия и кристаллического йода в соотношении 2:1) на 1—2 минуты до почернения препарата.
- Раствор сливают, мазок прополаскивают 96° этиловым спиртом или ацетоном, наливая и сливая его, пока мазок не обесцветится и стекающая жидкость не станет чистой (приблизительно 20—40—60 секунд).
- Тщательно промывают стекла в проточной или дистиллированной воде 1—2 мин.
- Для выявления грамотрицательной группы бактерий препараты дополнительно окрашивают фуксином или сафранином (2—5 мин).
- Промывают в проточной воде и высушивают фильтровальной бумагой.
Техника окраски бактерий в гистологических срезах по Граму-
- Депарафинированные срезы доводят до воды.
- Окрашивают 20 мин в 1 % растворе парарозанилина или основного фуксина в 1 % уксусной кислоте (раствор красителя нагревают до кипения, охлаждают и фильтруют).
- Промывают в 3 сменах дистиллированной воды.
- Окрашивают 5 мин в 1 % кристаллического фиолетового в дистиллированной воде.
- Быстро ополаскивают в 1 % растворе хлорида натрия.
- Обрабатывают 30 с в смеси: 1 часть иода + 2 части йодида калия + 100 частей дистиллированной воды.
- Промокают фильтровальной бумагой.
- Дифференцируют, нанося на срез смесь равных объёмов анилина и ксилола (1 — 2 мл); растворы сливают до тех пор, пока облачка красителя не перестанут отходить от среза.
- Проводят через 3 смены ксилола.
- Заключают в бальзам или любую смолу, растворённую в ксилоле.
Результат: грамположительные бактерии — сине-чёрные, фибрин — фиолетовый, ядра — красные.
См. также
Литература
- Грама метод // Гоголь — Дебит. — М. : Советская энциклопедия, 1972. — (Большая советская энциклопедия : [в 30 т.] / гл. ред. А. М. Прохоров ; 1969—1978, т. 7).
На немецком языке
- [англ.]. Über die isolierte Färbung der Schizomyceten in Schnitt- und Trockenpräparaten (нем.) // Fortschritte der Medizin : magazin. — 1884. — Bd. 2. — S. 185—189.
На английском языке
- Bergey, David H.; John G. Holt; Noel R. Krieg; Peter H.A. Sneath. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (англ.). — 9th ed.. — [англ.], 1994.
- Madigan, MT; Martinko J; Parker J. Brock Biology of Microorganisms (неопр.). — 10th Edition. — [англ.], 2004.
- Ryan, KJ; Ray, C. G. Sherris Medical Microbiology (неопр.). — 4th ed.. — McGraw Hill., 2004.
- Application of stains in clinical microbiology // Biotechnic & Histochemistry, Volume 76, Number 3, May 01, 2001, pp. 119—125(7)
Википедия, чтение, книга, библиотека, поиск, нажмите, истории, книги, статьи, wikipedia, учить, информация, история, скачать, скачать бесплатно, mp3, видео, mp4, 3gp, jpg, jpeg, gif, png, картинка, музыка, песня, фильм, игра, игры, мобильный, телефон, Android, iOS, apple, мобильный телефон, Samsung, iphone, xiomi, xiaomi, redmi, honor, oppo, nokia, sonya, mi, ПК, web, Сеть, компьютер, Информация о Метод Грама, Что такое Метод Грама? Что означает Метод Грама?
U etogo termina sushestvuyut i drugie znacheniya sm Metod znacheniya Metod Grama metod okraski mikroorganizmov dlya issledovaniya pozvolyayushij differencirovat bakterii po biohimicheskim svojstvam ih kletochnoj stenki Predlozhen v 1884 godu datskim vrachom Gansom Kristianom Gramom Grampolozhitelnaya Bacillus anthracis fioletovye palochki v obrazce spinnomozgovoj zhidkosti Drugie kletki lejkocity Okraska po Gramu Staphylococcus aureus grampolozhitelnye kokki i Escherichia coli gramotricatelnye bacilly Po Gramu bakterii okrashivayut anilinovymi krasitelyami gencianovym ili metilovym fioletovym i dr zatem krasitel fiksiruyut rastvorom ioda Pri posleduyushem promyvanii okrashennogo preparata spirtom te vidy bakterij kotorye okazyvayutsya prochno okrashennymi v sinij cvet i imeyushie tolstuyu kletochnuyu stenku nazyvayut grampolozhitelnymi bakteriyami oboznachayutsya Gram v otlichie ot gramotricatelnyh tonkaya kletochnaya stenka Gram kotorye pri promyvke obescvechivayutsya Posle promyvaniya rastvoritelem pri okrashivanii po Gramu dobavlyaetsya kontrastnyj krasnyj krasitel kotoryj okrashivaet vse gramotricatelnye bakterii v krasnyj ili rozovyj cvet Test klassificiruet bakterii razdelyaya ih na dve gruppy otnositelno stroeniya ih kletochnoj stenki Ispolzovanie v diagnostikeOkraska po Gramu imeet bolshoe znachenie v sistematike bakterij a takzhe dlya mikrobiologicheskoj diagnostiki infekcionnyh zabolevanij Grampolozhitelny kokkovye krome predstavitelej roda Neisseria i sporonosnye za isklyucheniem Coxiella burnetii formy bakterij oni okrashivayutsya v sine chyornyj tyomno sinij cvet Gramotricatelny mnogie nesporonosnye bakterii oni okrashivayutsya v krasnyj ili rozovyj cvet Tehnika provedeniya okraskiOkraska po Gramu otnositsya k slozhnomu sposobu okraski kogda na mazok vozdejstvuyut dvumya krasitelyami iz kotoryh odin yavlyaetsya osnovny m a drugoj dopolnitelnym Krome krasyashih veshestv pri slozhnyh sposobah okraski primenyayut obescvechivayushie veshestva spirt kisloty i dr Dlya okraski po Gramu chashe ispolzuyut anilinovye krasiteli trifenilmetanovoj gruppy gencianovyj metilovyj fioletovyj ili kristallviolet Grampolozhitelnye mikroorganizmy dayut prochnoe soedinenie s ukazannymi krasitelyami i jodom Pri etom oni ne obescvechivayutsya pri vozdejstvii na nih spirtom vsledstvie chego pri dopolnitelnoj okraske fuksinom grampolozhitelnye mikroorganizmy ne izmenyayut pervonachalno prinyatyj fioletovyj cvet Gramotricatelnye mikroorganizmy obrazuyut s osnovnymi krasitelyami i iodom legko razrushayusheesya pod dejstviem spirta soedinenie V rezultate mikroby obescvechivayutsya a zatem okrashivayutsya fuksinom priobretaya krasnyj cvet Podgotovka materiala dlya okraski Issleduemyj material raspredelyayut tonkim sloem po poverhnosti horosho obezzhirennogo predmetnogo stekla Prigotovlennyj mazok vysushivayut na vozduhe i posle polnogo vysyhaniya fiksiruyut Gistologicheskie srezy gotovyat po standartnoj metodike fiksiruya kusochki tkanej v formaline i zalivaya v parafin Fiksaciya Pri fiksirovanii mazok zakreplyaetsya na poverhnosti predmetnogo stekla i poetomu pri posleduyushej okraske preparata mikrobnye kletki ne smyvayutsya Krome togo ubitye mikrobnye kletki okrashivayutsya luchshe chem zhivye Razlichayut fizicheskij sposob fiksacii v osnovu kotorogo polozheno vozdejstvie vysokoj temperatury na mikrobnuyu kletku i himicheskie sposoby predusmatrivayushie primenenie himicheskih sredstv vyzyvayushih koagulyaciyu belkov citoplazmy Fizicheskij sposob fiksacii Predmetnoe steklo s preparatom berut pincetom ili I i II palcami pravoj ruki za ryobra mazkom kverhu i plavnym dvizheniem provodyat 2 3 raza nad verhnej chastyu plameni gorelki Ves process fiksacii dolzhen zanimat ne bolee 2 s Nadyozhnost fiksacii proveryayut sleduyushim priyomom svobodnuyu ot mazka poverhnost predmetnogo stekla prikladyvayut k tylnoj poverhnosti levoj kisti Pri pravilnom fiksirovanii mazka steklo dolzhno byt goryachim no ne vyzyvat oshusheniya ozhoga 70 80 C Himicheskij sposob fiksacii Dlya fiksacii mazkov primenyayut metilovyj spirt aceton smes Nikiforova smes etilovogo spirta 96 i narkoznogo efira v sootnoshenii 1 1 zhidkost Karnua 96 procentnogo etilovogo spirta 60 hloroforma 30 ledyanoj uksusnoj kisloty 10 spirt formol 40 procentnogo formalina 5 ml 96 procentnogo etilovogo spirta 95 ml Predmetnoe steklo s vysushennym mazkom pogruzhayut v sklyanku s fiksiruyushim veshestvom na 10 15 minut i zatem vysushivayut na vozduhe Primenyaetsya takzhe fiksaciya v parah 40 procentnogo formalina v techenie neskolkih sekund Process okrashivaniya mazkov Na fiksirovannyj mazok nalivayut odin iz osno vnyh krasitelej na 2 3 minuty Vo izbezhanie osadkov okrashivayut cherez filtrovalnuyu bumagu Slivayut krasku akkuratno udalyayut filtrovalnuyu bumagu Mazok zalivayut rastvorom Lyugolya ili jodistym rastvorom po Gramu vodnyj rastvor jodida kaliya i kristallicheskogo joda v sootnoshenii 2 1 na 1 2 minuty do pocherneniya preparata Rastvor slivayut mazok propolaskivayut 96 etilovym spirtom ili acetonom nalivaya i slivaya ego poka mazok ne obescvetitsya i stekayushaya zhidkost ne stanet chistoj priblizitelno 20 40 60 sekund Tshatelno promyvayut stekla v protochnoj ili distillirovannoj vode 1 2 min Dlya vyyavleniya gramotricatelnoj gruppy bakterij preparaty dopolnitelno okrashivayut fuksinom ili safraninom 2 5 min Promyvayut v protochnoj vode i vysushivayut filtrovalnoj bumagoj Tehnika okraski bakterij v gistologicheskih srezah po Gramu Deparafinirovannye srezy dovodyat do vody Okrashivayut 20 min v 1 rastvore pararozanilina ili osnovnogo fuksina v 1 uksusnoj kislote rastvor krasitelya nagrevayut do kipeniya ohlazhdayut i filtruyut Promyvayut v 3 smenah distillirovannoj vody Okrashivayut 5 min v 1 kristallicheskogo fioletovogo v distillirovannoj vode Bystro opolaskivayut v 1 rastvore hlorida natriya Obrabatyvayut 30 s v smesi 1 chast ioda 2 chasti jodida kaliya 100 chastej distillirovannoj vody Promokayut filtrovalnoj bumagoj Differenciruyut nanosya na srez smes ravnyh obyomov anilina i ksilola 1 2 ml rastvory slivayut do teh por poka oblachka krasitelya ne perestanut othodit ot sreza Provodyat cherez 3 smeny ksilola Zaklyuchayut v balzam ili lyubuyu smolu rastvoryonnuyu v ksilole Rezultat grampolozhitelnye bakterii sine chyornye fibrin fioletovyj yadra krasnye Sm takzheOkraska mikroorganizmov Anilinovye krasiteliLiteraturaGrama metod Gogol Debit M Sovetskaya enciklopediya 1972 Bolshaya sovetskaya enciklopediya v 30 t gl red A M Prohorov 1969 1978 t 7 Na nemeckom yazyke angl Uber die isolierte Farbung der Schizomyceten in Schnitt und Trockenpraparaten nem Fortschritte der Medizin magazin 1884 Bd 2 S 185 189 Na anglijskom yazyke Bergey David H John G Holt Noel R Krieg Peter H A Sneath Bergey s Manual of Determinative Bacteriology angl 9th ed angl 1994 Madigan MT Martinko J Parker J Brock Biology of Microorganisms neopr 10th Edition angl 2004 Ryan KJ Ray C G Sherris Medical Microbiology neopr 4th ed McGraw Hill 2004 Application of stains in clinical microbiology Biotechnic amp Histochemistry Volume 76 Number 3 May 01 2001 pp 119 125 7 Mediafajly na Vikisklade
